浅析青霉素结合蛋白测定技术
当前，细菌耐药性问题日趋严重，给临床治疗带来困难，对卜内酞胺类抗生素而言，某些菌青霉素结合蛋白(PBps)改变造成的耐药性，是卜内酞胺类抗生素的特点。一般细菌的PBPs均为胞浆膜上的蛋白质，是细菌致死的靶位。它的数目、位置、亲和力的变化造成与卜内酞胺类抗生素不易结合而产生耐药性。人们常采用SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳和放射自显影的方法
研究PBPs图谱，以便了解敏感菌和耐药菌的区别。所以，PBPs测定技术是
研究压内酸胺类耐药性的重要手段。用一般放射自显影法不能获得PBPs图谱，需采用荧光闪烁剂增效的“荧光放射自显影法”。国内有关PBps测定技术报道甚少，以3H标记者更少，本文介绍这一技术。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1菌种肺炎链球菌31003，30301（北京药品生物制品检定所）；Pen08.R6本室保存菌种。
1.1.2培养基C+Y培养基。
1.1.3仅器及药品
垂直板凝胶电泳槽(吴县科研仪器厂)；NG一l型真空凝胶干燥器(太仓电视机厂)；TGLL一1a型台式高速冷冻离心机(中科院上海生物化学
研究所)；8438一超低温冰箱(FormaSclentifi。，美国)；电泳仪DY一1型(上海医用
分析仪器厂)；丙烯酞胺(Aerylamide，临海止学厂产)；甲撑双丙烯酞胺.(big；瑞士产品)；N，N，N，N一四甲基乙二胺(TEMED，上海前进农场制剂厂)；3H标记青霉素乙酞呱陡盐(NewEngiandNuclear，美国)；x光底片(天津感光材料厂；KodakDiangnostiefilmX一OmatAR13X18em)；2，5一二苯基嗯哇(PPO，闪烁纯，上海试剂一厂)；月桂酞肌氨酸钠(Sarkosyl，Sigma)；十二烷基硫酸钠(SDs，上海新华化工厂)；二甲基亚矾(DMso，北京旭东化工厂)。
1.2 方法
1.2.1肺炎链球菌PBPs样品的制备将肺炎链球菌按种c+Y培养基37℃过夜培养，次日再移种新鲜培养基中，37℃培养2~3h至对数生长期，菌数约为个/ml(CFU/ml)，菌液分装试管，每管lml于冰浴中加入不同浓度的氖标记青霉素37℃保温10min，在冰浴中加入5非标记青霉素G钠盐20万单位/ml，冷冻离心5000：/minlom仇，弃去上清，菌体沉淀用50以磷酸缓冲液(PH6.8)做成菌悬液，然后加入5一10拼一20%sarkosyl，37℃保温10min使细胞溶解，加入30协一样品缓冲液，煮沸3min，置室温备用。
1.2.2聚丙烯鱿胺凝胶电泳采用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDSPAGE)方法。制备凝胶薄片(厚0.2cm)，凝胶配方：分离胶(10%)：Aerylamide：bis(30：0.5)6.7ml，Tris(pH8.8，1.5ml/ l)5ml，10%SDS 0.2ml，蒸馏水8.1ml，真空搅拌10一15min除去气体，再加入TEMED，浓缩胶(5%)：按上述配方依次为1.7ml，2.5ml，0.1而，5.6ml，7.5，和150。先配制分离胶，灌注直立式电泳槽后，使凝胶凝固。次日加入浓缩凝胶，放入加样梳，静置2h。在加样槽内依次分别加入PBps样品。接通电流，第一小时维持电压在60v，至染料前沿到达分离胶和浓缩胶交界处调高电压至120v，走完全程约需3一4h，用考马斯蓝R250染色30一45min，过夜脱色。
1.2.3关光放射自显影方法凝胶片用二甲基亚矾(DMSo)处理30min，再用新鲜DMSo再次处理30而n，20%即。处理2一3h，l%甘油和1%乙酸处理lh，将凝胶片贴附在厚滤纸上，使用凝胶真空干燥器进行真空干燥，将凝胶片和x光底片贴紧，置于x光射线暗匣内，放超低温冰箱一70℃使曝光1~Zwr，将x光底片显影，定影，冲洗得到PBPs的放射自显影图谱。x光底片预曝光条件：国产x光底片用照相闪光灯红色滤光片，加6层红色玻璃纸滤过，x光底片上覆盖6层红色玻璃纸，距离50cm，闪光灯闪二次；进口x光底片预曝光用x光机最小功率100mA40kV，距离40em，每张x光底片曝光0.04s。
1.2.4竟争性结合试验定量菌液中分别加入不同浓度的甲氧西林保温37℃10min，然后加入饱和量的氛标记青霉素，37℃保温10min，再按上述方法继续进行实验。
2 结果与讨论
本法测定肺炎链球菌全细胞中pBps的含量，首先需要分离菌体蛋白，为使菌体蛋白浓度维持在一定的水平上，必须控制菌龄和菌液浓度。菌液浓度约CFU/ml。肺炎链球菌破碎细胞的方法以采用离子型去污剂sarkosyl为宜，它能选择性地作用于胞浆膜，使胞浆膜破裂，菌体蛋白释放出来，与此同时，已经与青霉素结合的膜蛋白PBPs也一起释放出来。样品制备完毕，煮沸3min，以便除去某些蛋白质的干扰，青霉素与PBPs结合较牢固，不会被破坏。
本实验采用SDS一PAGE方法，SDS在分离胶与浓缩胶中的终浓度均为0.1%。分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为5%。
氖标记物穿透力较弱，用一般放射自显影方法不能得出图象，本实验采用荧光放射自显影法(Fluoro，aphy)，检测聚丙烯酞胺凝胶片上3H标记的蛋白质，有一定的优点。PPO是荧光增效剂，其作用原理不是直接依赖sH放射出来的日射线，而是藉助3H上的日粒子与PPO相互作用发射出的光，造成x光底片的局部发黑得到深浅不同的暗线，从而获得青霉素结合蛋白的图谱。肺炎链球菌的PBPs图谱上可见有三条区带，即p即；(a，b)，pBpZ和pBp3。一般情况下，青霉素浓度越大，亲和力越强，颜色越深，在竞争性试验中，甲氧西林浓度越大，亲和力越强，颜色越浅。
据报道，x光底片预曝光可增加荧光放射自显影法的灵敏度，因为预曝光可以纠正样品放射性和x光底片图象吸收值之间的非线性关系，所以，经预曝光的x光底片上所得到的图象可以正确反映出样品的放射性分布情况。
用国产x光底片不经预曝光时，无图象出现，经预曝光则有图象出现，用进口x光底片未经预曝光者，图象的暗线区别不大。预曝光后的x光底片显示出暗线深浅不同的正确图象。国产x光底片与进口x光底片比较，国产片敏感性较低，预曝后的x光底片上出现的暗线普遍较浅且细。
